Recolección de muestras de cultivos de papa

Recolectar los tubérculos e inducir a su pudrición colocándolos en una bolsa plástica y poniendo a incubación durante 2 días hasta que los tubérculos estén blandos y con olor a pudrición.

Procesamiento de muestras de tejido vegetal

Seleccionar fragmentos de tejido con presencia de síntomas, lavar, desinfectar en una solución de hipoclorito de sodio al 5% por dos minutos y macerar en un mortero estéril y diluirlos con agua destilada estéril  para finalmente sembrarlos en agar peptona e incubarlos por 48 horas a 26 °C.

Aislamiento de bacterias

Observar las colonias con morfología y características de Erwinia carotovora.

Esta bacteria en agar peptona presenta unas colonias redondas, pequeñas, levantadas, ligeramente translúcidas.

Purificación del fago

Día 1: preparar y autoclavar medios de cultivo

Día 2: - Diluir las muestras de suelo, tomar 2 g de la muestra y colocar 25 ml de  agua destilada estéril.

-          Filtrar la dilución.

-          Con el filtrado, realizar una dilución 1:10 en SM buffer

-          Incubar a 4 C por 24 horas

-          Sembrar la bacteria hospedadora previamente aislada, en tubos de 15 ml conteniendo 5 ml del medio de enriquecimiento (MNM enriquecido con 10 mM de MgSO₄)

-          Incubar las bacterias con agitación a 37 C por 24 horas.

Día 3: - Centrifugar 25 ml de la muestra durante 25 min a 15000 rpm.

-          Filtrar el sobrenadante a través de filtros de 0,45 y 0,2 µm previamente humedecidos con agua destilada estéril.

-          Diluir el inóculo bacteriano en medio fresco

-   100µl en 400 µl (t1, t2, t3)

-   200 µl en 300 µl (t4, t5, t6)

-          Los tubos t1, t2, t4 y t5 incubar a 37 C durante 3 horas y los tubos t3 y t6, incubar a 37 C durante 24 horas.

-          Medir en el espectrofotómetro (600nm) los tubos incubados por 3 horas.

-          A los tubos t1 y t4 adicionar 5 ml de la muestra, y a los tubos t2 y t5 adicionar agua destilada estéril.

-          Incubar 37 C durante 24 horas.